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丙酮酸检测试剂盒(乳酸脱氢酶比色法)可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的丙酮酸含量。

在NADH存在条件下，乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸氧化，生成乳酸和NAD+，在弱碱性条件下平衡偏向丙酮酸氧化为乳酸的方向驱动反应，通过分光光度计或自动分析仪测定340nm处NADH吸光度的下降速率，计算出丙酮酸含量。

• 配制好的PA显色液，4℃保存，36h有效。
  
• 配制好的PA-LDH显色液，4℃保存，24h有效。
  
• 如果没有分光光度计，也可以使用酶标仪测定，我们推荐采用分光光度计，以使操作系统误差减小到最少；一次不应检测过多样品，以免因为时间误差而导致结果差异较大。
  
• 抗凝剂用肝素钠-氟化钠较好，抗凝血样品置于冰浴中送检，尽快分离出血浆等。
  
• 草酸抗凝剂对LDH有一定的抑制作用。
  
• 采用乳酸脱氢酶法检测全血丙酮酸时，一般不建议采用微板法，这是由于手工操作差异较大，尤其是该法对操作时间要求极其严格，操作难以标准化、统一化，检测结果不稳定。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
  
• 该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

• 准备样品：
  
  • 血浆、血清、尿液及其他体液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存。
    
  • 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清，-20℃冻存，用于PA的检测。
    
  • 高浓度样品：如果样品中含有较高浓度的PA，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释，如鸡血清、血浆可稀释5～10倍后检测。
• 配制标准品工作液：取丙酮酸标准(25mmol/L) 0.01mL溶解于0.49mL丙酮酸标准稀释液，使浓度达到0.5mmol/L，即为标准品工作液-丙酮酸标准(0.5mmol/L)；4℃避光保存，24h有效。
  
• 配制PA-LDH显色液(适用于自动分析仪)：取配制好的PA显色液10mL与LDH Solution 0.04mL混匀，即为PA-LDH显色液；4℃避光保存，24h有效。
  
• 分光光度计测定：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡；如果样品中的PA浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。
  

  加入物(mL)	空白管	标准管	测定管
  蒸馏水	0.15	-	-
  待测样品(血清、血浆、体液等)	-	-	0.15
  丙酮酸标准(0.5mmol/L)	-	0.15	-
  PA-LDH显色液	1.6	1.6	1.6
  充分混匀，蒸馏水调零，于340nm处读取空白管、标准管、测定管的吸光度，分别为A 空白1、A 标准1、A 测定1。
  LDH Solution	0.0066	0.0066	0.0066

  室温孵育1min，分光光度计立即测定340nm空白管、标准管、测定管的吸光度，分别为A _空白2、A _标准2、A _测定2，此后每隔1min读1次吸光度，直至读数稳定，分别为A _空白x、A _标准x、A _测定x。
  
• 自动分析仪测定：样品中的PA浓度过高，可以减少样品用量或稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管；根据实验室的自动分析仪性能设置参数如下供参考：
  

  参数	参考值
  温度	37℃
  pH	7.4
  波长	340nm
  延迟时间	30s
  检测时间	120s
  待测样品/丙酮酸标准(0.5mmol/L)体积	25μL
  PA-LDH显色液	275μL

  分别检测待测样品管吸光度的下降速率(ΔA_u/min)和标准管吸光度的下降速率(ΔA_s/min)。

• 分光光度计比色计算公式：
  丙酮酸(mmol/L)={(ΔA _测定?ΔA _空白)/(ΔA _标准?ΔA _空白}×0.5×D
  也可根据NADH毫摩尔吸光度计算：
  丙酮酸(mmol/L)=(ΔA测定?ΔA空白)×(1.7566/6.22)×(D/0.15)
  ΔA _测定=A _测定1?A _测定x
  ΔA _空白=A _空白1?A _空白x
  ΔA _标准=A _标准1?A _标准x
  D=稀释倍数
  1.7566=反应液的总体积(ml)
  6.22=NADH毫摩尔吸光度
  0.15=待测样品体积(ml)
  换算公式：丙酮酸(mg/dl)=丙酮酸(mmol/L)×8.8
  
• 自动分析仪计算公式：
  血清、血浆、尿液、脑脊液丙酮酸(mmol/L) ={(ΔA_u/min)/(ΔA_s/min)}×0.5
  组织丙酮酸(mmol/g) ={(ΔA_u/min)/(ΔA_s/min)}×{(0.5/待测样品蛋白浓度(g/L)}